一、PCR引物的设定

PCR引物的设定是为了便于使用，常见的应用液浓度为10微摩尔每升(10 picomolar, pM/L)。在实验中，可以根据体系的大小选择合适的引物量。对于引物的稳定性，尽管有人认为高浓度保存时间相对较长，但在实际情况下，引物在常温条件下放置一段时间通常不会出现问题。

二、引物的保存策略

如果引物使用频率不高，可以采取分批取用的方式，先将所需的量溶解出来，其余部分储存在-80度的冷冻环境中，这样可以保持长时间。设置引物浓度时，只需参考包装管上标注的浓度，如3.6纳米摩尔(nM)，按比例加入无菌双蒸水即可。

三、PCR引物的特性及选择

1. 引物长度：一般为15-30bp，常用的长度为18-27bp。

2. GC含量：适宜范围为40%-60%，上下游引物的GC含量和Tm值要保持接近。

3. Tm值：最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间。

4. ΔG值：反应了引物与模板结合的强弱程度，3’端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9。

5. 错配率：一般不要超过10%，否则会出现非目的条带。但某些特定情况下，应结合其在正确位点的引发效率进行比较。

6. Frq曲线：新引进的指标，解释序列片段存在的重复几率大小，选取引物时应选择Frq值相对较低的片段。

7. 其他特性：如引物二聚体及结构的能量、3’端的结构等，都影响引物的效果。

四、引物浓度的选择及影响

PCR引物的浓度是影响PCR反应的重要因素之一。引物浓度过高或过低都会对PCR反应产生负面影响。选择合适的引物浓度可以确保PCR反应的特异性和扩增效率。引物浓度一般选择在0.1-0.5μmol/L之间。在这个范围内，引物可以与模板DNA有效结合，启动PCR反应。引物浓度过高可能导致非特异性扩增和竞争抑制，而浓度过低则可能导致扩增效率降低和产量不足。因此在实际实验中，需要根据具体情况对引物浓度进行优化调整。

五、实际操作中的注意事项

拿到引物后，一般会有说明书说明引物的浓度。以1 OD的引物为例，其物质的量约为5 mmol。加入500 uL的水稀释后，引物的浓度为10 μmol/L。在25 uL的反应体系中，通常上下游引物各加入10 pmol。但具体的加入量可以根据实验需要进行调整。关键在于按照说明书正确稀释引物，然后进行实验调整。